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AlexaFluor 594

Alexa Fluor 594 dye is a bright, red-fluorescent dye that can be excited using the 561 nm or 594 nm laser lines. For stable signal generation in imaging and flow cytometry, Alexa Fluor 594 dye is pH-insensitive over a wide molar range.

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Cyan Fluorescent Protein (CFP) is a versatile biological marker for monitoring physiological processes, visualizing protein localization, and detecting transgenic expression in vivo. CFP can be excited by the 405 nm laser line and is optimally detected at 485 nm.

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Cy5 dye is a bright, far-red-fluorescent dye that can be excited using the 633 or 647 nm laser lines, and visualized Cy5 filter sets.  In addition to immunocytochemistry applications, Cy5 is also commonly used to label nucleic acids.

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A variety of cyanine 5.5 (Cy5.5) dyes has been used to label biological molecules for fluorescence imaging and other fluorescence-based biochemical analysis. They are widely used for labeling peptides, proteins and oligos etc. Cy5.5 dyes are one type of the most common red fluorophores.

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Cy7 is a near-IR fluor that is invisible to the naked eye (Excitation/emission maximum 750/776 nm). It is used in in vivo imaging applications, as well as the Cy7.5 dye.

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DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) is a fluorescent stain that binds strongly to A-T rich regions in DNA. It is used extensively in fluorescence microscopy. As DAPI can pass through an intact cell membrane, it can be used to stain both live and fixed cells, though it passes through the membrane less efficiently in live cells and therefore the effectiveness of the stain is lower.

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Ethidium Bromide

As with most fluorescent compounds, ethidium bromide is aromatic. Its core heterocyclic moiety is generically known as a phenanthridine, an isomer of which is the fluorescent dye acridine. Absorption maxima of EtBr in aqueous solution are at 210 nm and 285 nm, which correspond to ultraviolet light. As a result of this excitation, EtBr emits orange light with wavelength 605 nm.

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Fluorescein isothiocyanate (FITC) is a derivative of fluorescein used in wide-ranging applications including flow cytometry. FITC is the original fluoresce in molecule functionalized with an isothiocyanate reactive group (-N=C=S), replacing a hydrogen atom on the bottom ring of the structure. This derivative is reactive towards nucleophiles including amine and sulfhydryl groups on proteins.

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The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 amino acid residues (26.9 kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. Although many other marine organisms have similar green fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jellyfish Aequorea victoria. The GFP from A. victoria has a major excitation peak at a wavelength of 395 nm and a minor one at 475 nm. Its emission peak is at 509 nm, which is in the lower green portion of the visible spectrum.

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tdTomato is a genetic fusion of two copies of the dTomato gene (2) which was specifi cally designed for low aggregation (1). Its tandem dimer structure plays an important role in the exceptional brightness of tdTomato (Table I). Its excitation and emission maxima occur at 554 nm and 581 nm, respectively (1). Because tdTomato forms an intramolecular dimer, it behaves like a monomer, and has been used successfully for N- and C- terminal fusions. It shows excellent photostability and its half-time (t0.5) for maturation is one hour at 37°C.

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Tetramethylrhodamine (TRITC) is a bright orange-fluorescent dye with excitation ideally suited to the 532 nm laser line. It is commonly conjugated to antibodies and proteins for cellular imaging applications.

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Fluorescence Illumination

형광 관찰 조명장치의 종류


  • Mercury : 형광 현미경법에 가장 흔히 사용하는 광원으로, 자외선 및 가시광선 영역에서 아주 밝다.

Spectrum of mercury


  • Xenon : 가시광선에서 상대적으로 연속적인 스펙트럼을 가진다. 염료 및/또는 시료의 스펙트럼 특성을 정량적으로 분석하는 시스템에서는 제논 램프를 사용하는 것이 좋지만, 같은 와트수의 수은 램프만큼 밝지는 않다.
Spectrum of Xenon


  • LED :  약 10 ~ 40nm 범위의 상대적으로 좁은 스펙트럼 대역폭 내에서 빛을 방출한다는 고유의 특징이 있다. 일반적으로 정격 수명이 10,000시간 이상이고 50,000시간 이상 사용하는 경우도 많고, 전체 정격 수명에 걸쳐 출력 강도가 비교적 일정하게 유지된다.

    Spectrum of LED


  • Laser : 보통은 단색광의 좁은 스펙트럼 대역에서 극히 밝다. 하지만 레이저광의 간섭성으로 인해 샘플 영역에 균일한 조도로 비추기 어렵기 때문에 형광 현미경 검사에는 레이저가 거의 사용되지 않는다.

    Spectrum of LASER


  • Metal-halide : 유효수명이 최대 2000시간으로, 일반적인 수은 램프의 200시간이나 제논 램프의 400시간과 비교하면 훨씬 길다.



컨포칼 현미경 사이트에 오신 것을 환영합니다.  이것은 첫번째 글이며, 이제 부터 현미경을 위한 광학의 길을 걸어 봅시다.


편광 현미경

Polarization Microscopy


  • 편광현미경의 역사

19세기 중순 경 개발되어짐.

  • 편광현미경의 사용 용도

초기에는 암석과 광물의 연구에 주로 사용되어졌으나, 점차로 그 용도가 넓어져서 의약품, 공업제품 등 산업 전반에 걸쳐 이용분야가 확대 됨.

  • 편광현미경의 사용 목적

샘플의 광학적 성질을 조사하고,이를 통하여 샘플을 구성하는 물질이 무엇으로 이루어졌는지 동정 하기 위해 사용 됨.

  • 광학적 성질에 의한 샘플의 분류


: 샘플에 빛이 통과 할때 어떠한 방향으로 빛이 진행하더라도 모든 방향에 대하여 동일한 광학적 영향을 준다.(복굴절 하지 않는다.)

예: 유리 등


: 샘플에 빛이 통과 할때 빛이 진행하는 방향(각도)에 따라 다양한 복굴절을 한다.

일축성(isotropic body)

: 빛이 진행 할 때 복굴절하지 않는 광축을 하나만 가지고 있다.

예: 방해석, 석영 등

이축성(Anisotropic body)

: 빛이 진행 할 때 복굴절하지 않는 광축을 두개 가지고 있다.

 예: 운모, 장석, 각섬석, 휘석, 감람석 등



Filter Holder for BX50 WI

(OLYMPUS  – 32BP775)

45㎜ holder for 32㎜ filter


  •  45㎜ 필터용 위치에 32㎜ 필터를 사용할 수 있도록 만든  홀더
  • 여러개의 필터를 중첩하여 사용 가능함.
  • BX50-WI (Olympus)  광학 유닛 업그레이드시에 JNO-DICD-01과 같이 사용되어 지며,  32BP775 설치시에 필요한 홀더임.
45㎜ holder for 32㎜  filter
Filter holder for transmitted light (OLYMPUS BX)



위상차 현미경 관찰법

Phase contrast Microscopy

  • 위상차 관찰법 발명자 정보

Frits Frederik Zernike(네덜란드 과학자)

위상차 현미경 발명으로 노벨물리학상(1953)을 수상.

  •  발명 배경

  생물현미경에서 사용하는 대부분의 샘플은 무색투명한 특성을 가지고 있기때문에,  배율확대 만을 목적으로 하는 일반 현미경의 관찰법(Bright Field)에서는 투명하고 윤곽이 흐릿하게 보이기 때문에 제대로 된 관찰에 어려움이 있습니다.

  이 문제를 해결하기 위하여 샘플을 염색하는 방법이 사용하고 있습니다만,  이 방법으로는 살아있는 샘플의 관찰은 할 수 없습니다. 염색 도중에 샘플이 죽어버리기 때문입니다.

  • 위상차 현미경의 (개요)

위상차 관찰법(Phase-Contrast)은 샘플을 통과하는 직진광(하단 좌측 이미지)과 이 직진광이 샘플에 통과하면서 발생하는 회절광(하단 우측 이미지) 사이의 위상차 현상을 이용하여 살아있는 세포의 구조와 미생물의 상태변화를 볼게 있게 해주는 관찰법입니다.

  • 위상차 현미경의 원리 설명

  샘플의 한 포인트(샘플 평면 중의 한 점)를 통과하는 빛은 두 개의 광학 경로를 가지도록 설계 되어 있으며, 이 두개의 경로를 통과한 빛은 한점에 다시 한 점에 모여 확대된 상을 만들게 되지만, 다른 경로를 지나왔기 때문에 발생한 위상차에 의하여 보강 또는 소멸 간섭을 하게 된다.

  하단의 좌측이미지는 두개의 광학경로 중에 직진광의 경로이며, 하단의 우측이미지는 직진광이 샘플에 닿을때 발생하는 회절광의 경로이다. 참고로 직진광이 샘플이 없는 포인트를 지나가게 되면 산란이 생기지않아 회절광은 발생하지 않는다.

  회절광은 직진광의 위상에 비교하여 대략 1/4λ 지연되어 결상한다. 직진광은 위상판에 의하여 1/4λ 또는 3/4λ지연되어 결상한다.

  직진광이 위상판에 의하여 1/4λ 지연되어 회절광과 동일한 위상을 갖게 되면 직진광과 회절광의 위상이 서로 보강간섭을 하여 진폭이 커지게 되면 배경에서는 직진광의 영향만 받기 때문에 샘플이 배경 보다 밝게 보인다. (Negative contrast)

  반대로  직진광이 위상판에 의하여 위상이 3/4λ 지연되면 직진광과 회절광은 소멸 간섭을 하게 되어 샘플은 직진광의 영향만 받는 배경보다 어둡게 보인다. (Positive contrast)






Hoffman Modulation Contrast

호프만 모듈레이션(HMC)

Hoffman Modulation Contrast Microscopy

  •  용도 및 특징

    • 기본적으로 위상차 현미경 관찰법, 미분간섭관찰법과 동일한 목적으로 사용되어 진다.  무색투명한 표본을 특수한 광학적 원리를 이용하여 가시화 한다.  이를 통하여 살아있는 세포의 구조와 미생물의 움직임을 관찰하는 것이 가능하다.
    • 비스듬한(경사진)각도의 조명법으로도 비슷한 느낌의 입체감을 얻을 수 있다. 
    • 초점심도가 얕아서 조금씩 초점을 바꿔주면 광학적인 절단상을 연속해서 얻을 수 있다.
    • 미분간섭 관찰과의 차이점은 플라스틱 샤레 등의 편광성이 있는 용기에서도 사용이 가능하다. 
  • 원리

    • 구성

      • HMC용 콘덴서
        • 콘덴서의 상부에 편광판을 회전가능하게 하여 둔다
        • 콘덴서의 전측 초첨위치에 슬릿을 배치한다.
        • 상기 슬릿은 대물렌즈와 매칭되도록 교환이 가능
      • HMC용 대물렌즈
        • 대물렌즈의 후측조점 위치에 HMC모듈레이를 설치한 전용 렌즈



미분 간섭 관찰(DIC)

Differential Interference Contrast Microscopy(DIC)

Normaski Interference Contrast Microscopy(NIC)


  • 미분간섭관찰법 발명자

Georges (Jerzy) Nomarski (January 6, 1919 – 1997)

프랑스 귀화 물리학자(폴란드 태생)

  • 발명 배경

이 관찰법은 샘플이 두꺼운 경우에 후광에 의한 광학 노이즈가 발현되는 위상차 현미경과 다르게 후광 효과가 발현되지 않으며, 샘플에 입체감을 부여하여 보다 세밀한 관찰을 가능하게 합니다.

이 관찰법은 살아있는 생물학적 시료 및 염색을 하지 않은 조직의 관찰에 폭넓게 사용되고 있습니다.

  • DIC Microscopy 원리 설명

본 관찰법은 편광필터 2개(편광자, 검광자)와 DIC 프리즘 2개로 구성되어 진다.

가장 바깥쪽에 위치하는 편광 필터 2개(편광자,검광자)는 Cross Nichole 상태로 설치 되어 있어야 하며, 이는 두개의 유닛 사이에 광학적 특성의 변화가 있는 빛만을 통과시키겠다는 목적으로 이해하면 된다.

 편광자를 통과한 빛이 처음 프리즘에 통과하면 빛은 2개의 경로를 가지게 된다. 이 두 빛은 광학진동 방향이 직교하며, 매우 미소한 거리 차를 가지고 진행한다.

샘플을 통과하고 다음 프리즘을 통과하면서 빛은 다시 동일한 경로를 갖는 빛으로 합성되며, 이때 다른 경로를 통과하였기 때문에 동일한 위상을 갖지 못하는 경우가 발생한다.

  동일한 위상일 경우에는 보강간섭 그렇지 않는 경우에는 소멸간섭이 발생한다.

  • DIC Microscopy 용어 설명(보강)

Phase Shift 

조정 방법: 1/4람다 필터 또는 DIC 프리즘에 있는 회전 레버을 이용하여 조정한다.

발생 효과: 보여 지는 샘플의 음영을 바꿀수 있다.

쾰러 조명

최근에 사용되는 대부분의 관찰법은 쾰러 조명 세팅을 기본으로 하고 있음.

쾰러 조명을 기반으로 다양한 관찰법이 설계되어 있음. 

  • Bright Field Microscopy와 DIC Microscopy의 이미지 비교



형광 현미경 관찰법

Fluorescence Microscopy


  • 형광현미경의 소개

물체에 강한 빛을 조사할 때 발현되는 형광을 이용하여 물체의 구조를 관찰하거나 형광의 유무와 색조를 이용하여 물질을 판별한는 현미경입니다.

발현되는 형광의 양을 측광하여 물질의 특성을 파악하고자 하는 경우에도 사용되고 있습니다.

형광현미경에는 표본을 조사하는 방법의 차이에 의하여 반사형과 투과형이 있습니다만,  요즘에는 반사형 조사 방법이 주로 사용되어 지고 있습니다.

응용분야 로는

의학치학약학 생물학의 기초연구

임상위생검사, 가축위생, 식물내해 등의 시험연구

화학, 약품, 반도체관련 등의 공업분야에서도 넓게 사용되어지고 있다.

  • 형광의 특성

형광을 발현하기 위해서는 빛이 흡수가 필요합니다.

형광은 여기광의 입사방향과 관계없이 모든 방향으로 발현합니다.

일반적으로 형광의 강도는 여기광에 비교하여 매우 약합니다.

형광 파장은 여기광과 관계없이 일정합니다.

형광의 파장은 여기광(흡수광)의 파장보다 깁니다.(Stroke’s law)

형광은 정도의 차는 있지만 소광 또는 퇴색합니다.

Simple Polarization

간이 편광(Simple Po)

Simple Polarization  

  • Simple Polarization theory (원리 설명)

본 관찰법은 편광필터 2개(편광자, 검광자)로 이루어진다.

상기 이미지와 같이 편광자와 검광자가 90도 각도로 설치 되어 있는 상태를 흔히 직교니콜(Cross Nicol)이라고 불리면, 현미경에서의 주요 사용 목적은 광학적 특성의 변화가 있는 빛만을 통과시키고자 할 때 자주 사용된다.

일반적으로 빛은 모든 방향으로 진동하는 특성을 가지고 있으나, 세로 방향 편광자(좌측필터)를 통한 빛은 세로로 진동하는 빛만이 통과하게 되고, 우측 필터(검광자)는 세로 편광을 차단하는 역할을 하기 때문에 실제로 우측으로 투과되는 빛은 없다.

간이 편광 현미경에서는 편광자와 검광자의 사이에 샘플이 위치하게 되며, 샘플 재질이 등방체 특성을 가지고 있는 경우에는  샘플 만으로는 광학적 특성에 변화를 줄 수 없기 때문에 접안렌즈나 현미경 카메라 측에서 관찰 할 수 없는 어두운 이미지가 나오는 것이 일반적이다.

참고로 등방체가 아닌 물질인 플라스틱은 편광자를 통과하여 얻은 편광된 빛에 큰 영향을 주기 때문에 이를 염두에 두고 사용하여야 한다. 예를 들어, 미분간섭 관찰에서 광학 경로 상에 플라스틱과 같은 재질이  있으면, 미분간섭 관찰을 위한 광학 설계를 무의미하게 만들어 버린다.

  • Bright Field Microscopy와 Polarization Microscopy 이미지 비교